Питательные среды для лабораторной диагностики бактериозов рыб

В лабораториях, проводящих микробиологические исследования, основными целями являются поддержание жизнеспособности, восстановление жизнеспособности, выращивание и/или подсчет широкого спектра микроорганизмов. Во всех традиционных методах микробиологического культивирования, а также во многих альтернативных методах используют питательные среды.
Питательная среда - однокомпонентный или многокомпонентный субстрат, применяемый для культивирования микроорганизмов или культур клеток высших организмов.
Классификация микробиологических питательных сред

В микробиологии питательные среды разделяют на:
1. Натуральные (естественные) среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения и имеют неопределенный химический состав. К таким средам относятся овощные и фруктовые соки, животные ткани, кровь, молоко, яйца, желчь, сыворотка крови, а так же отвары и экстракты, полученные из различных природных субстратов.
2.Полусинтетические среды, в состав которых наряду с веществами неопределенного состава входят соединения известной химической природы.
3. Синтетические среды, содержат только химически чистые соединения в точно указанных концентрациях, т.е. состав их полностью известен. Преимущества таких сред - стандартность и воспроизводимость с высокой степенью точности. Их используют, главным образом, для экспериментального изучения метаболизма микроорганизмов, реже - для аналитических целей, диагностики, хранения культур.

По назначению различают:
1. Питательные среды общего назначения (базовые питательные среды) - пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и могут применяться в качестве основы для приготовления специальных питательных сред.
2. Специальные элективные (избирательные) среды применяются для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания или получения накопительных культур. Эти среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов, что достигается путем создания оптимальных условий для развития для одних микроорганизмов, т.е. положительной селекцией, или угнетением роста других, т.е. методом отрицательной селекции.
3. Специальные дифференциально-диагностические среды- применяют для изучения биохимических свойств и дифференцировки одного вида (рода) микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Дифференцирующие свойства питательной среды создаются путем внесения субстрата, к которому определяется отношение микроорганизма, и соответствующих рН-индикаторов.
4. Специальные консервирующие (транспортные) среды - используются в клинической практике для сохранения жизнеспособности микроорганизмов в период от момента взятия биоматериала до посева, основная цель использования - сохранение жизнеспособности возбудителя и подавление размножения сопутствующей флоры в период транспортировки образцов.

По консистенции различают:
1. Жидкие среды - применяют для изучения биохимических и физиологических свойств микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена, хранения микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах.
2. Полужидкие среды - используют для хранения культур, реже - для накопления биомассы.
3. Плотные среды - используют для выделения чистых культур, морфологии колоний, диагностических целей, хранения культур, количественного учета, изучения антагонистических свойств.
4. Сыпучие среды - используются для хранения посевного материала, культур-продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности.
5. Сухие питательные среды - представляют собой гигроскопические порошки влажностью до 10%, использующиеся для приготовления готовых питательных сред.
Свойства питательных сред

Питательная среда должна обладать определенным набором свойств:
1. Содержать достаточное количество питательных веществ, микроэлементов, минеральных солей;
2. Иметь определенную вязкость;
3. Иметь определенные влажность и/или кислотность;
4. Быть изотонической, то есть не нарушать нормальное функционирование клеток, проницаемость клеточных мембран; в большинстве случаев, среда должна быть прозрачной.

Наиболее широко используемые питательные среды
1. Среда Эндо-дифференциально-диагностическая питательная среда, предназначенная для выделения энтеробактерий. Обладает слабыми селективными свойствами, компоненты среды подавляют рост грамположительных бактерий
2. Эритрит агар - используют для выработки бруцелл. Среда является питательной основой, которая обеспечивает бактерии всеми необходимыми веществами. Кроме того, тиамин и эритрит выступают факторами роста бруцелл. В лабораторной практике можно добавлять различные антибиотики для предоставления среде селективных свойств.
3. Энтерококк агар - позволяет селективно выработать энтерококки и идентифицировать редукцию ТТХ (трифенилтетразолий хлористый). Селективный эффект достигается благодаря присутствию в составе среды азида натрия, который ингибирует рост грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий. Бактерии способные к редукции ТТХ накапливают внутри клеток фармазон, который придает колониям красный цвет
4. Агар Анакера-Ордала - предназначен для культивирования и поддерживания штаммов Flexibacter.
5. Агар Клиглера - предназначен для дифференциации бактерий по способности их ферментировать глюкозу, лактозу и образовывать сероводород.
6. Среда Хью-Лейфсона-предназначена для определения способа утилизации глюкозы или других углеводов у микроорганизмов по аэробному (окисление) и анаэробному пути (ферментация).
7. Висмут-сульфит агар - используют для селективного выделения и дифференциации сальмонеллы. Состав среды вызывает угнетение роста посторонней микрофлоры, а колонии выросшие имеют зеленовато-коричневый цвет. При этом стимулируется рост сальмонелл, а их способность к восстановлению висмута позволяет определить их по почернению колоний и среды под ними.
8. Агар для определения ДНКазы, ГРМ бульон, Мясопептонный агар (МПА), Среды Гисса с углеводами, Реактив Андреде, Среда Сабуро, и.т.д.

Этапы приготовления питательной среды
1. Взвешивание: отбирают навески компонентов питательной среды на аналитических весах;
2. Растворение: компоненты питательной среды растворяют в предварительно нагретой до 70 °С дистиллированной воде.
3. Кипячение: растворы питательных сред кипятят в течении 2 мин.
4. Установление pH: ориентировочно производят с помощью индикаторной бумаги, для точного определения пользуются потенциометром. При стерилизации pH снижается на 0,2, поэтому сначала готовят более щелочной раствор.
5. Розлив сред: питательные среды разливают не более чем на 3/4 емкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.
6. Стерилизация: для стерилизации питательный сред используют термический способ: стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование), дробная стерилизация (тиндализация), кипячение. Режим стерилизации зависит от состава среды и указан в её рецепте. При автоклавировании 3–5 % жидкости теряется в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объема примерно 5 % дистиллированной воды. Тогда после стерилизации среда будет иметь требуемую концентрацию.
8. Контроль:
• для контроля стерильности среды ставят на 2 суток в термостат, после чего их просматривают.
• химический контроль окончательно устанавливает pH, содержание общего и амминого азота, пептона, хлоридов.
• для биологического контроля несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами, и по их росту судят о питательных свойствах среды.